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Lecciones de biología
Transformación y selección bacteriana
Transferencia de ADN de plásmido a bacterias. Cómo se seleccionan las bacterias. Producción y purificación de proteínas.
Puntos más importantes:
- Las bacterias pueden recolectar ADN de otros organismos en un proceso llamado transformación.
- La transformación es un paso clave en la clonación de ADN. Ocurre después de los tratamientos de digestión con enzimas de restricción y ligación y transfiere plásmidos recién hechos a las bacterias.
- Después de la transformación, las bacterias se seleccionan en placas con antibióticos. Las bacterias con un plásmido son resistentes a los antibióticos y cada una formará una colonia.
- Las colonias con el plásmido adecuado pueden cultivarse para producir grandes cultivos de bacterias idénticas que se utilizan para producir plásmido o hacer proteína.
Visión general: la clonación de ADN
La transformación y la selección de bacterias son pasos clave en la clonación de ADN. La clonación de ADN es el proceso de hacer muchas copias de un fragmento de ADN específico, como un gen. Con frecuencia, las copias se hacen en bacterias.
En un experimento de clonación típico, los investigadores primero insertan un fragmento de ADN específico, como un gen, en otro fragmento circular de ADN llamado plásmido. Este paso usa enzimas de restricción y ADN ligasa, y se llama ligación.
Después de una ligación, el siguiente paso es transferir el ADN a las bacterias en un proceso llamado transformación. Luego, podemos utilizar una selección con antibióticos y métodos de análisis de ADN para identificar las bacterias que contienen el plásmido que estamos buscando.
Los pasos de la transformación y la selección bacteriana
Este es un procedimiento típico para la transformación y selección de bacterias:
- Bacterias preparadas especialmente se mezclan con ADN (de una ligación, por ejemplo).
- Se aplica un choque de calor a las bacterias lo que provoca que algunas recolecten el plásmido.
- Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, todas las bacterias se colocan en una placa con antibióticos para seleccionar las que recolectaron plásmido.
- Las bacterias sin plásmido mueren. Cada bacteria con plásmido da lugar a una colonia o comunidad de bacterias idénticas que contiene el plásmido.
- Varias colonias se analizan para identificar una con el plásmido adecuado (por PCR o con enzimas de restricción, por ejemplo).
- Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir proteína o plásmido.
¿Por qué necesitamos analizar las colonias?
Todas las bacterias que forman colonias deberían contener un plásmido (que proporciona resistencia a los antibióticos). Sin embargo, no necesariamente es el caso que todas las colonias que contienen plásmidos tendrán el mismo plásmido.
¿Cómo es que pasa eso? Al cortar y pegar ADN, es posible la formación de productos secundarios además del plásmido que se pretende construir. Por ejemplo, al tratar de insertar un gen en un plásmido con una enzima de restricción en particular, puede haber casos donde el plásmido se cierra en su forma original (sin incorporar el gen) o casos donde el gen está en dirección inversa.
¿Qué importa si un gen entra al revés en el plásmido? En algunos casos, no importa. Sin embargo, si queremos expresar el gen en las bacterias para producir una proteína, el gen debe apuntar en la dirección correcta en relación al promotor, o la secuencia control que induce la expresión génica. Si el gen estuviera al revés, se transcribiría la cadena equivocada de ADN y no se produciría ninguna proteína.
Debido a estas posibilidades, es importante recolectar ADN plasmídico de cada colonia y comprobar si coincide con el plásmido que intentábamos construir. Para analizar el ADN plasmídico de colonias bacterianas, se utiliza digestión con enzimas de restricción, PCR y secuenciación de ADN.
Producción de proteínas en bacterias
Supongamos que identificamos una colonia con un plásmido "bueno". ¿Qué sigue? ¿Qué sentido tiene transformar, seleccionar y analizar?
Posibilidad 1: bacterias = fábricas de plásmido
En algunos casos, las bacterias simplemente se utilizan como "fábricas de plásmido" para hacer una gran cantidad de ADN plasmídico. El ADN plasmídico se puede utilizar en pasos posteriores de clonación de ADN (por ejemplo, para construir plásmidos más complejos) o en diversos tipos de experimentos.
En algunos casos, los plásmidos tienen aplicaciones prácticas directas. Por ejemplo, recientemente en un ensayo clínico de terapia génica para pacientes con el trastorno genético fibrosis quística, se utilizaron plásmidos para administrar un gen humano en tejido pulmonarstart superscript, 1, end superscript.
Posibilidad 2: bacterias = fábricas de proteína
En otros casos, las bacterias se pueden utilizar como fábricas de proteínas. Si un plásmido contiene las secuencias de control adecuadas, se puede inducir a las bacterias a expresar el gen que contienen al agregar una señal química. La expresión del gen conduce a la producción de ARNm que se traduce en proteína. Luego, las bacterias pueden lisarse (reventarse) para liberar la proteína.
Las bacterias contienen muchas proteínas y macromoléculas. Debido a esto, la proteína recién hecha se debe purificar (separar de las demás proteínas y macromoléculas) antes de poder utilizarla. Hay una variedad de técnicas diferentes que se usan para purificar proteínas.
En una técnica llamada cromatografía de afinidad, una mezcla de moléculas extraídas de las bacterias lisadas fluye a través de una columna, un cilindro que contiene perlas. Las perlas están recubiertas con un anticuerpo, una proteína del sistema inmunitario que se une específicamente a una molécula blanco.
El anticuerpo de la columna está diseñado para unirse a nuestra proteína de interés y no a cualquier otra molécula de la mezcla. De esta manera, la columna retiene la proteína de interés, mientras que las otras moléculas son arrastradas por el flujo. En la etapa final, la proteína de interés se libera de la columna y se recolecta para su uso.
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¿Quieres saber más sobre la selección de bacterias transformadas? Mira esta simulación de LabXchange.
LabXchange es una plataforma de educación en ciencias gratuita en línea creada en la Facultad de Artes y Ciencias de Harvard que recibe apoyo de Amgen Foundation.
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Con un plasmido de resistencia antibiótica. Al plasmido que deseas ingresar a la bacteria le añades el gen de interés y así mismo un gen de resistencia a un antibiótico. Cuando siembres el el medio de cultivo, a este le añades altas concentraciones del antibiótico seleccionado y únicamente las bacterias que crezcan en el medio serán las que tienen el plasmido con el gen de resistencia al antibiótico y por ende, tu gen de interés.(1 voto)
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