Transformación y selección bacteriana

Transferencia de ADN de plásmido a bacterias. Cómo se seleccionan las bacterias. Producción y purificación de proteínas.

Puntos más importantes:

  • Las bacterias pueden recolectar ADN de otros organismos en un proceso llamado transformación.
  • La transformación es un paso clave en la clonación de ADN. Ocurre después de los tratamientos de digestión con enzimas de restricción y ligación y transfiere plásmidos recién hechos a las bacterias.
  • Después de la transformación, las bacterias se seleccionan en placas con antibióticos. Las bacterias con un plásmido son resistentes a los antibióticos y cada una formará una colonia.
  • Las colonias con el plásmido adecuado pueden cultivarse para producir grandes cultivos de bacterias idénticas que se utilizan para producir plásmido o hacer proteína.

Visión general: la clonación de ADN

La transformación y la selección de bacterias son pasos clave en la clonación de ADN. La clonación de ADN es el proceso de hacer muchas copias de un fragmento de ADN específico, como un gen. Con frecuencia, las copias se hacen en bacterias.
En un experimento de clonación típico, los investigadores primero insertan un fragmento de ADN específico, como un gen, en otro fragmento circular de ADN llamado plásmido. Este paso usa enzimas de restricción y ADN ligasa, y se llama ligación.
Después de una ligación, el siguiente paso es transferir el ADN a las bacterias en un proceso llamado transformación. Luego, podemos utilizar una selección con antibióticos y métodos de análisis de ADN para identificar las bacterias que contienen el plásmido que estamos buscando.

Los pasos de la transformación y la selección bacteriana

Este es un procedimiento típico para la transformación y selección de bacterias:
  1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con ADN (de una ligación, por ejemplo).
  2. Se aplica un choque de calor a las bacterias que las "convence" de recolectar el plásmido. La mayoría de las bacterias no recolecta plásmido, pero algunas sí lo hacen.
  3. Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, todas las bacterias se colocan en una placa con antibióticos para seleccionar las que recolectaron plásmido.
  4. Las bacterias sin plásmido mueren. Cada bacteria con plásmido da lugar a una comunidad de bacterias idénticas que contiene el plásmido llamada colonia. Una colonia típica se ve como un pequeño punto blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.
  5. Varias colonias se analizan para identificar una con el plásmido adecuado.
  6. Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir proteína o plásmido.
  1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con ADN (de una ligación, por ejemplo).
  2. Se aplica un choque de calor a las bacterias lo que provoca que algunas recolecten el plásmido.
    La respuesta simple es que el choque de calor hace que la membrana de la bacteria sea más permeable a las moléculas de ADN, como los plásmidos. Al parecer, el choque térmico provoca la formación de poros en la membrana bacteriana, a través de los cuales pueden pasar las moléculas de ADN.
  3. Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, todas las bacterias se colocan en una placa con antibióticos para seleccionar las que recolectaron plásmido.
Diagrama de un plásmido. El plásmido contiene un gen de resistencia a antibióticos, un promotor para estimular la expresión génica en las bacterias y el gen blanco que se insertó durante la ligación.
  1. Las bacterias sin plásmido mueren. Cada bacteria con plásmido da lugar a una colonia o comunidad de bacterias idénticas que contiene el plásmido.
  2. Varias colonias se analizan para identificar una con el plásmido adecuado (por PCR o con enzimas de restricción, por ejemplo).
  3. Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para producir proteína o plásmido.

¿Por qué necesitamos analizar las colonias?

Todas las bacterias que forman colonias deberían contener un plásmido (que proporciona resistencia a los antibióticos). Sin embargo, no necesariamente es el caso que todas las colonias que contienen plásmidos tendrán el mismo plásmido.
¿Cómo es que pasa eso? Al cortar y pegar ADN, es posible la formación de productos secundarios además del plásmido que se pretende construir. Por ejemplo, al tratar de insertar un gen en un plásmido con una enzima de restricción en particular, puede haber casos donde el plásmido se cierra en su forma original (sin incorporar el gen) o casos donde el gen está en dirección inversa.
Izquierda: el gen entra al plásmido en sentido hacia adelante (apuntando en la misma dirección que la secuencia del promotor). Este es el plásmido deseado de la ligación.
Centro: el plásmido se cierra sin incorporar el gen. Este no es un plásmido útil.
Derecha: el gen entra al plásmido en sentido inverso (apuntando hacia la secuencia del promotor). Este no es un plásmido útil si queremos expresar el gen en bacterias.
Digamos que estamos tratando de insertar un gen en un plásmido para que se pueda expresar en bacterias. Para ello, debemos "pegar" el gen en el plásmido junto al promotor, apuntando en la misma dirección:
Materiales para comenzar:
  • Gen blanco digesto en ambos extremos con una enzima de restricción particular.
  • Plásmido cortado con la misma enzima de restricción en un sitio después de un promotor para la expresión bacteriana. El promotor "apunta" hacia la derecha, lo que significa que impulsará la transcripción de la secuencia de ADN que se encuentra a la derecha.
Lo que queremos conseguir es:
  • Un plásmido recombinante donde se inserta el gen blanco después del promotor, apuntando en la dirección hacia adelante (orientada por lo que se transcribe para hacer un ARNm que especifica la proteína deseada).
Supongamos que cortamos nuestro gen y el plásmido con la misma enzima y unimos los fragmentos con ADN ligasa. En algunos casos, el ADN del plásmido y del gen se combinan de manera correcta y forman el plásmido que buscamos. Sin embargo, en otros casos, el plásmido simplemente puede cerrarse (sin incorporar el gen) o el gen puede entrar al plásmido en dirección contraria. Las bacterias no pueden expresar un gen en dirección contraria para producir una proteína.
Izquierda: el gen entra al plásmido en sentido hacia adelante (apuntando en la misma dirección que la secuencia del promotor). Este es el plásmido deseado de la ligación.
Centro: el plásmido se cierra sin incorporar el gen. Este no es un plásmido útil.
Derecha: el gen entra al plásmido en sentido inverso (apuntando hacia la secuencia del promotor). Este no es un plásmido útil si queremos expresar el gen en bacterias.
En una ligación participan muchos fragmentos de ADN (miles de millones de copias del plásmido y miles de millones de copias del gen). Por lo tanto, en cada ligación, obtendremos algún número de plásmidos "buenos" y algún número de "malos". Cada colonia se origina de una sola bacteria con un único plásmido, por lo que todas las bacterias de una colonia tendrán el mismo plásmido ("bueno" o "malo").
Consulta el artículo sobre enzimas de restricción y la ADN ligasa, donde encontrarás un ejemplo más concreto que explica cómo y por qué se forman los diferentes productos de la ligación.
¿Qué importa si un gen entra al revés en el plásmido? En algunos casos, no importa. Sin embargo, si queremos expresar el gen en las bacterias para producir una proteína, el gen debe apuntar en la dirección correcta en relación al promotor, o la secuencia control que induce la expresión génica. Si el gen estuviera al revés, se transcribiría la cadena equivocada de ADN y no se produciría ninguna proteína.
Debido a estas posibilidades, es importante recolectar ADN plasmídico de cada colonia y comprobar si coincide con el plásmido que intentábamos construir. Para analizar el ADN plasmídico de colonias bacterianas, se utiliza digestión con enzimas de restricción, PCR y secuenciación de ADN.

Producción de proteínas en bacterias

Supongamos que identificamos una colonia con un plásmido "bueno". ¿Qué sigue? ¿Qué sentido tiene transformar, seleccionar y analizar?

Posibilidad 1: bacterias = fábricas de plásmido

En algunos casos, las bacterias simplemente se utilizan como "fábricas de plásmido" para hacer una gran cantidad de ADN plasmídico. El ADN plasmídico se puede utilizar en pasos posteriores de clonación de ADN (por ejemplo, para construir plásmidos más complejos) o en diversos tipos de experimentos.
En algunos casos, los plásmidos tienen aplicaciones prácticas directas. Por ejemplo, recientemente en un ensayo clínico de terapia génica para pacientes con el trastorno genético fibrosis quística, se utilizaron plásmidos para administrar un gen humano en tejido pulmonar1^1.

Posibilidad 2: bacterias = fábricas de proteína

En otros casos, las bacterias se pueden utilizar como fábricas de proteínas. Si un plásmido contiene las secuencias de control adecuadas, se puede inducir a las bacterias a expresar el gen que contienen al agregar una señal química. La expresión del gen conduce a la producción de ARNm que se traduce en proteína. Luego, las bacterias pueden lisarse (reventarse) para liberar la proteína.
La colonia elegida crece en un cultivo grande. Se induce la expresión del gen blanco en las bacterias de ese cultivo mediante la adición de una señal química al medio de cultivo. Dentro de cada bacteria, el gen blanco se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen blanco se acumula dentro de las bacterias.
Las bacterias contienen muchas proteínas y macromoléculas. Debido a esto, la proteína recién hecha se debe purificar (separar de las demás proteínas y macromoléculas) antes de poder utilizarla. Hay una variedad de técnicas diferentes que se usan para purificar proteínas.
Las células que fabricaron proteína se revientan (lisan) y liberan la proteína y otros contenidos celulares. Las moléculas extraídas de las células se aplican a una columna que contiene anticuerpos específicos para la proteína blanco. Así, la columna retiene la proteína y deja pasar las demás moléculas de la bacteria. En el último paso, después de que todas las proteínas que no nos interesan se han lavado, las proteínas blanco se liberan de los anticuerpos de la columna y se recolecta la proteína pura para su uso.
En una técnica llamada cromatografía de afinidad, una mezcla de moléculas extraídas de las bacterias lisadas fluye a través de una columna, un cilindro que contiene perlas. Las perlas están recubiertas con un anticuerpo, una proteína del sistema inmunitario que se une específicamente a una molécula blanco.
El anticuerpo de la columna está diseñado para unirse a nuestra proteína de interés y no a cualquier otra molécula de la mezcla. De esta manera, la columna retiene la proteína de interés, mientras que las otras moléculas son arrastradas por el flujo. En la etapa final, la proteína de interés se libera de la columna y se recolecta para su uso.
Este artículo está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias citadas:

  1. Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial (Nebulización reiterada con terapia génica no viral del gen CFTR en pacientes con fibrosis quística: Un ensayo fase 2b aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo). Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Referencias complementarias:

Affibody. (s.f.). Insulin capture from human serum (Captura de insulina de suero humano). Consultado en http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.
Amgen Biotech Experience. (2015). Guía para el estudiante. Consultado en https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.
Bacterial transformation: The heat shock method. (Transformación bacteriana: el método de choque de calor; 2016). En Base de datos educativa de ciencias JoVE. Consultado en http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method.
Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (Un gran avance en la terapia génica para fibrosis quística; 3 de julio de 2015). En NHS choices. Consultado en http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology (El ADN como herramienta y la biotecnología). En Campbell biology (10° ed., págs. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.
Wilkin, D. (23 de marzo de 2016). Gene cloning - advanced (Clonación génica avanzada). En CK-12: conceptos avanzados de biología. Consultado en http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.
Cargando