Resumen: clonación de ADN

Definición, propósito y pasos básicos de la clonación de ADN.

Puntos más importantes:

  • La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un fragmento de ADN, como un gen.
  • En un experimento típico de clonación, se inserta un gen blanco en un fragmento circular de ADN llamado plásmido.
  • El plásmido se introduce en bacterias mediante un proceso llamado transformación y las bacterias que contengan el plásmido se seleccionan mediante antibióticos.
  • Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para hacer más ADN plasmídico o, en algunos casos, se induce la expresión del gen para hacer proteína.

Introducción

Cuando escuchas la palabra "clonación" tal vez pienses en la clonación de organismos completos, como Dolly la oveja. Sin embargo, lo único que significa clonar algo es hacer una copia genéticamente exacta de ese algo. En un laboratorio de biología molecular, lo que se clona con más frecuencia es un gen u otro fragmento pequeño de ADN.
Si tu amiga la bióloga molecular dice que su "clonación" no está funcionando, es casi seguro que está hablando de copiar fragmentos de ADN, ¡no de hacer la siguiente Dolly!

Resumen de la clonación de ADN

La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente importante) se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante. Un fragmento circular de ADN plasmídico tiene extremos irregulares que coinciden con los de un fragmento del gen. El plásmido y el fragmento de gen se unen para producir un plásmido que contenga el gen. Este plásmido que contiene el gen es un ejemplo de ADN recombinante, una molécula de ADN ensamblada a partir de ADN de múltiples fuentes.
A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el plásmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta forma hacen copias del ADN que contienen.
¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un plásmido? En algunos casos, necesitamos muchas copias de ADN para realizar experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el fragmento de ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan como "fábricas" para producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en bacterias E. coli para producir la insulina que usan los diabéticos.
Como sabrás, si tienes amigos o familiares diabéticos, la hormona insulina juega un papel importante en la salud humana. En el cuerpo de una persona sana, el páncreas produce insulina. Esta hormona viaja por el torrente sanguíneo y se une a las células del cuerpo para permitir la absorción del azúcar glucosa.
En una persona con diabetes tipo I, las células del páncreas que producen insulina están dañadas o destruidas. Las personas con diabetes tipo I regularmente deben inyectarse con insulina que se obtuvo de otra fuente para prevenir concentraciones peligrosamente altas de glucemia (y para permitir que el azúcar entre a las células del cuerpo como combustible).
Durante muchos años, toda la insulina utilizada por personas con diabetes tipo I se obtenía del páncreas de cerdos y vacas que habían sido sacrificadas por su carne. La molécula de insulina es similar entre los seres humanos, cerdos y vacas, por lo que la insulina de cerdo o vaca puede sustituir la insulina humana en el cuerpo de personas con esta enfermedad.
Sin embargo, a partir de la década de los 80, científicos desarrollaron nuevas técnicas para obtener insulina humana mediante bacterias Escherichia coli (E. coli). Básicamente, convirtieron las bacterias en pequeñas fábricas productoras de insulina. Esta insulina recombinante, insulina obtenida de combinar ADN de múltiples fuentes (seres humanos y bacterias), es ahora el principal tratamiento utilizado por personas con diabetes tipo I.

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo la clonación de ADN se puede utilizar para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:
  1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).
  2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con antibióticos para identificar las bacterias que incorporaron el plásmido.
  3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como "fábricas" para producir la proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y purificarla.
Revisemos con más detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN

¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método habitual utiliza dos tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa.
Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.
Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:
  • El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.
  • El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que contenga el gen.
Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la ligación en un esquema simplificado.
Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En ambos extremos del gen blanco hay sitios de restricción, secuencias de ADN reconocidas por una enzima de restricción particular. En el plásmido, también hay un sitio de restricción reconocido por esa misma enzima, justo después de un promotor que dirigirá su expresión en bacterias.
El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima de restricción. Los fragmentos se purifican y se combinan. Ambos tienen "extremos cohesivos", o salientes de ADN de cadena sencilla, por lo que pueden pegarse.
La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos complementarios para formar una única molécula completa de ADN. Esto produce un plásmido recombinante que contiene el gen blanco.

2. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros tipos de ADN en bacterias, como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación, células bacterianas preparadas especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que las anima a incorporar ADN extraño.
El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados, plásmidos de productos secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor, que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las bacterias incorporará con éxito un plásmido.
¡Magnífica pregunta! Curiosamente, nadie parece estar completamente seguro de la respuesta, aunque la transformación por choque térmico es una técnica muy común en la biología molecular. En general, se piensa que el choque de calor cambia la fluidez de la membrana o causa la formación de poros (agujeros), lo que facilita que el ADN cruce y entre a la célula1^1.
Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite a las bacterias sobrevivir en presencia de un antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el plásmido pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga el antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que contienen plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo con forma de punto, o colonia, de bacterias idénticas que contienen el mismo plásmido.
Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos.
Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se colocan en una placa con antibióticos. Las bacterias sin plásmido mueren a causa del antibiótico. Cada bacteria que tenga plásmido forma una colonia, un grupo de bacterias clonales que contienen el mismo plásmido. Una colonia típica se ve como un punto pequeño y blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.
No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso es porque, durante una ligación, los fragmentos de ADN no siempre se "pegan" exactamente como queremos. Por el contrario, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido correcto. Se usan métodos como la digestión con enzimas de restricción y la PCR para revisar los plásmidos.

3. Producción de proteínas

Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado, podemos hacer crecer un gran cultivo de bacterias que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal química que les ordena producir la proteína blanco.
Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el gen y traducir el ARNm para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina humana.
Los seres humanos y las bacterias comparten el mismo código genético, lo que significa que un gen humano puede ser transcrito y traducido en bacterias.
Sin embargo, para que un gen humano se exprese en bacterias, debe tener una modificación importante. En concreto, debe carecer de intrones. Los intrones son secuencias interpuestas que se encuentran en muchos genes humanos y se eliminan de los transcritos de ARN eucariontes mediante empalme para formar un ARNm maduro. Las bacterias no tienen intrones y no pueden empalmar transcritos de ARN.
¿Cómo podemos obtener una versión de un gen humano sin intrones? Puede hacerse una versión sin intrones de un gen humano a partir del ARNm que codifica el gen, mediante el uso de la enzima transcriptasa reversa. La transcriptasa reversa sintetiza una cadena de ADN usando una cadena de ARNm como molde. Después de un paso adicional se produce una versión del gen de ADN de doble cadena sin intrones (llamado ADNc).
La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la expresión del gen contenido en el plásmido en las bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen se acumula dentro de las bacterias.
Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas otras proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína blanco (la insulina en nuestro ejemplo). Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o separada del resto del contenido de las células con técnicas bioquímicas. La proteína purificada puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina, administrarse a pacientes.
Pues... sí y no. La insulina recombinante que hacen las compañías farmacéuticas de verdad se genera en bacterias y se expresa de un plásmido que contiene un gen modificado de la insulina humana. La insulina que producen las bacterias se purifica mediante un tipo de columna de purificación.
Sin embargo, producir insulina biológicamente activa requiere algunos pasos adicionales. La insulina se produce como una cadena polipeptídica única. Sin embargo, se deben formar puentes disulfuro dentro de la cadena y parte de ella debe cortarse para formar dos cadenas separadas (que se mantienen juntas únicamente por los puentes disulfuro). Solo entonces la insulina es biológicamente activa, es decir, capaz de actuar como una hormona en el cuerpo de un paciente.
La producción de insulina que pueden usar los diabéticos requiere que estos pasos adicionales se incorporen al procedimiento de purificación de proteína para que la proteína insulina alcance su forma tridimensional correcta.

Usos de la clonación de ADN

Las moléculas de ADN construidas mediante técnicas de clonación se utilizan para muchos fines en la biología molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:
  • Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN puede utilizarse para producir proteínas humanas con aplicaciones biomédicas, como la insulina mencionada anteriormente. Otros ejemplos de proteínas recombinantes incluyen la hormona del crecimiento humana, que se administra a pacientes que son incapaces de sintetizarla, y el activador tisular del plasminógeno (tPA), que se utiliza para tratar infartos y prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas suelen producirse en bacterias.
  • Terapia génica. En algunas transtornos genéticos, los pacientes carecen de la forma funcional de un gen en particular. La terapia génica intenta proporcionar una copia normal del gen a las células del cuerpo del paciente. Por ejemplo, la clonación de ADN se utilizó para construir plásmidos que contuvieran una versión normal del gen que falla en la fibrosis quística. Cuando se suministraban los plásmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis quística, la función pulmonar se deterioraba más lentamente2^2.
  • Análisis genético. En laboratorios de básica investigación, los biólogos suelen usar la clonación de ADN para crear versiones recombinantes artificiales de genes que les ayudan a entender cómo funcionan los genes normales de un organismo.
    Por ejemplo, los investigadores que estudian las neuronas en moscas de la fruta podrían utilizar la clonación de ADN para ensamblar una construcción reportera de un gen neuronal. En esta construcción, la región reguladora (promotor) del gen se puede pegar delante de un gen que codifique una proteína fluorescente. Cuando se transfiere a la mosca, el "gen reportero" se expresará en las mismas neuronas que el gen neuronal mismo, de forma que esas neuronas brillan (fluorescen) bajo luz UV.
Estos son solo algunos ejemplos de cómo hoy en día se utiliza la clonación de ADN en la biología. La clonación de ADN es una técnica muy común que se utiliza en una gran variedad de aplicaciones de la biología molecular.
Este artículo está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias citadas:

  1. Superbest. (11 de junio de 2011). How does heat shock transformation work? (¿Cómo funciona la transformación por choque de calor?). En Biology stack exchange. Consultado en http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
  2. Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial (Nebulización reiterada con terapia génica no viral del gen CFTR en pacientes con fibrosis quística: un ensayo fase 2b aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo). Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Referencias complementarias:

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Amgen Biotech Experience. (2015). Guía para el estudiante. Consultado en https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.
Biotechnology (Biotecnología; 23 de marzo de 2016). Consultado el 29 de marzo de 2016 en Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.
Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication (Fabricación de insulina: una mirada tras bambalinas a la producción de un medicamento que salva vidas). En Diabetes forecast. Consultado en http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.
Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (Un gran avance en la terapia génica para fibrosis quística; 3 de julio de 2015). En NHS choices. Consultado en http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.
R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein (La proteína recombinante hormona del crecimiento humana). En Growth hormone. Consultado en https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology (El ADN como herramienta y la biotecnología). En Campbell biology (10° ed., págs. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.
Wilkin, D. (23 de marzo de 2016). Gene cloning - advanced (Clonación génica avanzada). En CK-12: conceptos avanzados de biología. Consultado en http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.
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