Las enzimas de restricción y la ADN ligasa

Digestión con enzimas de restricción. Extremos cohesivos y extremos romos. Reacciones de ligación.

Puntos más importantes:

  • Las enzimas de restricción son enzimas que cortan ADN. Cada enzima reconoce una o un número pequeño de secuencias blanco y corta el ADN en o cerca de esas secuencias.
  • Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados que producen extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos producen extremos romos.
  • La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la ligasa puede unirlos para formar una molécula única e intacta de ADN.
  • En la clonación de ADN, se utilizan enzimas de restricción y ADN ligasa para insertar genes y otros fragmentos de ADN en plásmidos.

¿Cómo se corta y pega el ADN?

En la clonación de ADN de ADN, los investigadores hacen muchas copias de un fragmento de ADN específico, como un gen. En muchos casos, la clonación consiste en introducir el gen en un fragmento de ADN circular llamado plásmido que puede copiarse en bacterias.
¿Cómo se pueden unir fragmentos de ADN de diferentes fuentes (como un gen humano y un plásmido bacteriano) para hacer una sola molécula de ADN? Un método común utiliza enzimas de restricción y ADN ligasa.
  • Una enzima de restricción es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios específicos en él. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en o cerca de su sitio de reconocimiento y producen extremos sobresalientes de cadena sencilla.
  • Si dos moléculas de ADN tienen extremos complementarios, la enzima ADN ligasa puede unirlos. La ADN ligasa sella el espacio entre las moléculas para formar un solo fragmento de ADN.
Las enzimas de restricción y la ADN ligasa se suelen usar para insertar genes y otros fragmentos de ADN en plásmidos durante la clonación de ADN.

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada enzima de restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su secuencia blanco, la enzima de restricción cortará las dos cadenas de una molécula de ADN. Por lo general, el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y predecible.
Se piensa que las enzimas de restricción evolucionaron como un mecanismo de defensa que le permitía a las bacterias cortar en fragmentos más pequeños el ADN exógeno potencialmente nocivo (por ejemplo, ADN de virus que infectan bacterias).
Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia de ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio. EcoRI corta en el siguiente sitio:
5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'
Sitio de EcoRI
Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:
Una enzima EcoRI se une a un sitio EcoRI en un fragmento de ADN y hace cortes en ambas cadenas del ADN. El patrón de corte es:
5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'
De esta manera se produce un extremo de 5'-AATT-3' que sobresale en cada extremo del ADN cortado.
Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque también se cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por complementariedad de bases. Por esta razón se dice que las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla producen extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son útiles en la clonación porque mantienen dos fragmentos de ADN juntos para que la ADN ligasa los pueda unir.
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen "extremos romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla. La enzima de restricción SmaI es un ejemplo de enzima que corta así:
La enzima SmaI se une aI sitio de restricción de SmaI , que es:
5'-...CCCGGG...-3' 3'-...GGGCCC...5'
La enzima corta en medio de esta secuencia en ambas cadenas y produce extremos romos. Los sitios de corte son:
5'-...CCC|GGG...-3' 3'-...GGG|CCC...5'
La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle) porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de ADN en su posición.
Las enzimas de restricción se nombran por la especie procarionte de la que son aisladas. Por ejemplo, el nombre de las enzimas aisladas de bacterias Escherichia coli comenzaría con Eco (como EcoRI).
Se han aislado más de 3, comma000 enzimas de restricción de diferentes organismos. Algunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla:
NombreFuenteSitio de reconocimientoPatrón de corte
EcoRIEscherichia coli
BamHIBacillus amyloliquefaciens
HindIIIHaemophilus influenzae
SmaISerratia marcescens
SacIStreptomyces achromogenes
Tabla modificada de "Endonucleasas de restricción comunes", de CK-12 Foundation (CC BY-NC-SA 3.0).

La ADN ligasa

Si ya conoces la replicación del ADN, tal vez ya te hayas encontrado con la ADN ligasa. En la replicación del ADN, el trabajo de la ADN ligasa es unir fragmentos de ADN recién sintetizados para formar una cadena continua. Las ligasas utilizadas en la clonación de ADN hacen básicamente lo mismo. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, la ADN ligasa puede unirlos para formar una molécula sin interrupciones.
Fragmento de ADN 1:
5'-...G 3'-...CTTAA
Fragmento de ADN 2:
AATTC...-3' G...-5'
Las regiones de cadena sencilla de las dos moléculas pueden unirse por puentes de hidrógeno, pero aún hay huecos en el esqueleto:
5'-...G|AATTC...-3' 3'-...CTTAA|G...-5'
La ADN ligasa sella los huecos para producir una molécula de ADN intacta:
5'-...GAATTC...-3' 3'-...CTTAAG...-5'
¿Cómo logra esto la ADN ligasa? Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción produce un esqueleto de azúcar-fosfato intacto.

Ejemplo: construcción de un plásmido recombinante

Vamos a ver cómo la digestión con enzimas de restricción y la ligación pueden utilizarse para insertar un gen en un plásmido. Supongamos que tenemos un gen blanco, flanqueado por los sitios que reconoce EcoRI, y un plásmido que contiene un solo sitio de EcoRI:
Comenzamos con un gen blanco y un plásmido circular. El gen blanco tiene dos sitios de restricción para EcoRI cerca de sus extremos. El plásmido tiene un sitio para EcoRI justo después de un promotor que estimula la expresión en bacterias. La secuencia de los sitios de EcoRI es:
5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'
Nuestro objetivo es utilizar la enzima EcoRI para insertar el gen en el plásmido. Primero, digerimos (cortamos) por separado con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este paso produce fragmentos con extremos cohesivos:
Por separado, digerimos (cortamos) con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este paso produce fragmentos con extremos cohesivos. Todos los extremos tienen un extremo sobresaliente de cuatro nucleótidos con la secuencia 5'-AATT-3'. Eso es porque el patrón de corte de EcoRI es:
5'-G|AATTC-3' 3'-CTTAA|G-5'
A continuación, tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los combinamos con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por apareamiento complementario de bases:
Ahora, tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los combinamos con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por apareamiento complementario de bases. Sin embargo, todavía existen huecos en el esqueleto de azúcar-fosfato de la doble hélice del ADN en los sitios de unión entre el gen y ADN del plásmido.
Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y tenemos un plásmido recombinante.
Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y tenemos un plásmido recombinante. En el plásmido, el gen ahora está flanqueado por dos sitios de EcoRI que se generaron cuando los extremos cortados se ligaron entre sí.

En la digestión con enzimas de restricción y la ligación participan muchas moléculas de ADN

En el ejemplo anterior, vimos un resultado de la ligación entre un gen y un plásmido con EcoRI. Sin embargo, en esta misma reacción de ligación podrían ocurrir otros resultados. Por ejemplo, el plásmido cortado podría recircularizarse (cerrarse en su estado original) sin incorporar el gen. Asimismo, el gen podría entrar al plásmido, pero en dirección contraria (puesto que sus dos extremos cohesivos de EcoRI son idénticos).
Izquierda: plásmido recombinante producido cuando el gen entra en sentido hacia adelante ("apuntando" en la dirección del promotor que se encuentra en el plásmido).
Centro: plásmido no recombinante que se produce cuando el plásmido cortado simplemente se vuelve a cerrar (sus extremos se ligan entre sí).
Derecha: plásmido recombinante producido cuando el gen entra en sentido inverso ("apuntando" en dirección contraria al promotor que se encuentra en el plásmido).
La digestión con enzimas de restricción y la ligación como esta se realiza con muchas copias de ADN del plásmido y del gen. De hecho, en una sola ligación se utilizan ¡miles de millones de moléculas de ADN! Todas estas moléculas están chocando entre sí y con la ADN ligasa al azar y de diferentes maneras. Por lo tanto, si es posible formar varios productos, todos se producirán con cierta frecuencia, incluyendo los que no queremos.
¿Cómo podemos evitar plásmidos "malos"? Cuando transformamos bacterias con el ADN de una ligación, cada una toma un fragmento diferente de ADN. Después de la transformación, podemos revisar las bacterias y usar solo aquellas que tengan el plásmido correcto. En muchos casos, el plásmido de las bacterias transformadas se analiza mediante otra digestión con enzimas de restricción para ver si contienen el inserto correcto en la orientación correcta.

Créditos:

Este artículo es una versión modificada de "Clonación de ADN - curso avanzado", de CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).
El artículo modificado está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias:

Bergmann, D. (2011). Biotecnología. [Material para clase] En BIO41: 2011 Clases de biología molecular sobre ADN, ARN y biotecnología.
Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases (Clase 5: Endonucleasas de restricción). En Recombinant DNA techniques (Técnicas de ADN recombinante). Consultado en http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology (El ADN como herramienta y la biotecnología). En Campbell biology (10° ed., págs. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.
Restriction site. (Sitio de restricción; 7 de diciembre de 2015). Tomado de Wikipedia el 31 de marzo de 2016: https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site.
Restriction endonucleases. (Endonucleasas de restricción; 2016). En New England biolabs. Consultado en https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases.