Cómo se determina la secuencia de las bases de nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) en un fragmento de ADN.

Puntos más importantes:

  • La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN.
  • En la secuenciación de Sanger, el ADN blanco es copiado muchas veces y se hacen fragmentos de diferentes longitudes. Nucleótidos fluorescentes que actúan como "terminadores de cadena" marcan los extremos de los fragmentos y permiten la determinación de la secuencia.
  • Las técnicas de secuenciación de nueva generación son estrategias nuevas a gran escala que aumentan la velocidad y reducen el costo de la secuenciación del ADN.

¿Qué es la secuenciación?

Tal vez hayas oído que se están secuenciando genomas. Por ejemplo, el genoma humano se finalizó en 2003 después de un esfuerzo internacional de muchos años. Pero, ¿qué significa secuenciar un genoma o incluso un pequeño fragmento de ADN?
La secuenciación de ADN es el proceso que determina la secuencia de bases de los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN. Hoy en día, con el equipo y los materiales adecuados, secuenciar un fragmento pequeño de ADN es relativamente sencillo.
Secuenciar un genoma completo (todo el ADN de un organismo) sigue siendo una tarea compleja. El proceso requiere romper el ADN del genoma en muchos pedazos más pequeños, secuenciar dichos pedazos y ensamblar las secuencias en una única y larga "secuencia consenso". Sin embargo, gracias a nuevos métodos que se han desarrollado en las últimas dos décadas, ahora secuenciar un genoma es mucho más rápido y menos costoso de lo que resultó en el Proyecto Genoma Humano1^1.
En este artículo, revisaremos los métodos que se usan para secuenciar el ADN. Analizaremos principalmente un método bien establecido, la secuenciación de Sanger, pero también analizaremos nuevos métodos ("de nueva generación") que han reducido el costo y aumentado la velocidad de la secuenciación a gran escala.

Secuenciación de Sanger: el método por terminación de cadena

Rutinariamente se secuencian regiones de ADN de hasta 900900 pares de bases con un método llamado secuenciación de Sanger o método por terminación de cadena. Este método de secuenciación fue desarrollado por el bioquímico británico Fred Sanger y sus colegas en 1977.
En el Proyecto Genoma Humano, se utilizó la secuenciación de Sanger para determinar las secuencias de muchos fragmentos relativamente pequeños de ADN humano. (Estos fragmentos no necesariamente eran de 900900 pb o menos, pero los investigadores pudieron "recorrer" la longitud de cada fragmento con múltiples rondas de secuenciación de Sanger). Los fragmentos se alinearon con base en porciones que se traslapaban para ensamblar la secuencia de regiones más grandes de ADN y, al final, cromosomas completos.
Aunque actualmente los genomas se secuencian con otros métodos que son más rápidos y menos costosos, la secuenciación de Sanger todavía se usa ampliamente para secuenciar piezas individuales de ADN, como los fragmentos utilizados en la clonación de ADN o los generados a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Ingredientes para la secuenciación de Sanger

La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN. Sus ingredientes son similares a los necesarios para la replicación del ADN en un organismo o para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Los ingredientes son:
  • Una enzima ADN polimerasa
  • Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
  • Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
  • El molde de ADN que será secuenciado.
Sin embargo, una reacción de secuenciación de Sanger también contiene un ingrediente único:
  • Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color diferente.
Los nucleótidos didesoxi son similares a los nucleótidos normales, o desoxi, pero con una diferencia clave: no tienen grupo hidroxilo en el carbono 3' del anillo de azúcar. En un nucleótido normal, el grupo hidroxilo 3' actúa como un "gancho" que permite que un nuevo nucleótido se añada a una cadena existente.
Una vez que se añade a la cadena un nucleótido didesoxi, ya no hay un hidroxilo sobre el que se puedan agregar más nucleótidos. La cadena termina con el nucleótido didesoxi, que está marcado con pigmento de un color particular dependiendo de la base (A, T, C o G) que lleve.

Método de secuenciación de Sanger

La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el cebador, la ADN polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). También se añaden los cuatro nucleótidos didesoxi terminadores de la cadena, marcados con su pigmento, pero en cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos normales.
Primero se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN (separar las cadenas) y luego se enfría para que el cebador pueda unirse al molde de cadena sencilla. Una vez que se ha unido el cebador, se eleva la temperatura para que la ADN polimerasa pueda sintetizar ADN nuevo a partir del cebador. La ADN polimerasa añadirá nucleótidos a la cadena hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno normal. A partir de ese momento, no es posible agregar más nucleótidos y la cadena termina con el nucleótido didesoxi.
Este proceso se repite cierto número de ciclos. Cuando los ciclos terminan, está prácticamente garantizado que se ha incorporado un nucleótido didesoxi en cada una de las posiciones del ADN blanco en al menos una reacción. Es decir, el tubo contendrá fragmentos de diferentes longitudes que terminan respectivamente en cada una de las posiciones de los nucleótidos del ADN original (observa la siguiente figura). Los extremos de los fragmentos tendrán el pigmento que indica su nucleótido final.
Cuando la reacción termina, los fragmentos se hacen pasar a través de un tubo largo y delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado electroforesis capilar en gel. Los fragmentos cortos se mueven rápidamente a través de los poros del gel, mientras que los fragmentos largos se mueven más lentamente. Cuando cada fragmento cruza la "línea de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y permite la detección del pigmento asociado.
El fragmento más pequeño (que termina justo un nucleótido después del cebador) es el primero que cruza la línea de meta, seguido por el próximo fragmento más pequeño (que termina justo dos nucleótidos después del cebador) y así sucesivamente. De esta manera, se puede reconstruir nucleótido por nucleótido la secuencia del fragmento de ADN original a partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el detector. Los datos registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la fluorescencia, como se muestra en el cromatograma anterior. La secuencia del ADN se lee a partir de los picos en el cromatograma.

Usos y limitaciones

La secuenciación de Sanger arroja secuencias de alta calidad para segmentos relativamente largos de ADN (de hasta aproximadamente 900900 pares de bases). La técnica suele utilizarse para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como plásmidos bacterianos o ADN copiado en la PCR.
Sin embargo, la secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente para proyectos a gran escala, como la secuenciación de un genoma completo o un metagenoma (el "genoma colectivo" de una comunidad microbiana). Para tareas como estas, las nuevas técnicas de secuenciación a gran escala son más rápidas y menos costosas.

Secuenciación de nueva generación

El nombre puede sonar como de Star Trek, ¡pero de verdad así se llama! El conjunto más reciente de tecnologías de secuenciación de ADN se denominan secuenciación de nueva generación.
Hay una variedad de técnicas de secuenciación de nueva generación que utilizan diferentes tecnologías. Sin embargo, la mayoría comparte un conjunto común de características que las distinguen de la secuenciación de Sanger:
  • Altamente paralelas: ocurren muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo.
  • Microescala: las reacciones son diminutas y se pueden hacer muchas a la vez en un chip.
  • Rápidas: puesto que las reacciones se realizan en paralelo, los resultados están listos mucho más rápido.
  • Bajo costo: secuenciar un genoma es más barato que con la secuenciación de Sanger.
  • Longitudes más cortas: típicamente, las lecturas se obtienen con fragmentos de entre 5050 700700 nucleótidos de longitud.
Conceptualmente, la secuenciación de nueva generación es como hacer un número muy grande de pequeñas reacciones de secuenciación de Sanger en paralelo. Gracias a esta paralelización y a la pequeña escala, los métodos de última generación permiten secuenciar grandes cantidades de ADN de forma mucho más rápida y barata con que con la secuenciación de Sanger. Por ejemplo, en 2001, el costo de secuenciar un genoma humano fue de casi $100\$100 millones\text{millones}. En el año 2015, ¡fue de solo $1245\$12452^2!
¿Por qué es importante que la secuenciación sea rápida y barata? La capacidad de secuenciar genomas de forma rutinaria abre nuevas posibilidades en la investigación biológica y en aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, la secuenciación de bajo costo es un paso hacia la medicina personalizada: un tratamiento médico a la medida de las necesidades de un individuo con base en las variantes génicas de su genoma.
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