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Curso: Lecciones de biología > Unidad 20
Lección 3: Métodos de análisis del ADNElectroforesis en gel
Una técnica que se usa para separar fragmentos de ADN y otras macromoléculas por tamaño y carga.
Puntos más importantes:
- La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.
- Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
- Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.
- Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.
Introducción
Imagina que acabas de hacer una reacción de PCR y se produjeron muchas copias de una región blanco de ADN. O tal vez hiciste alguna clonación de ADN tratando de "pegar" un gen en un plásmido circular de ADN.
Ahora, quieres ver si la PCR funcionó o si el plásmido contiene el gen correcto. ¿Qué técnica puedes usar para visualizar (observar directamente) los fragmentos de ADN?
Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño. La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También podemos determinar el tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una "escala" estándar de fragmentos de tamaño conocido.
¿Qué es un gel?
Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de material similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido llamado agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se calienta en una solución amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros.
En un extremo, el gel tiene muescas en forma de ranuras llamadas pozos, que son donde se colocarán las muestras de ADN:
Antes de agregar las muestras de ADN, el gel debe colocarse en una cámara. Uno de los extremos de la cámara se conecta a un electrodo positivo y el otro extremo se conecta a un electrodo negativo. El cuerpo principal de la cámara, donde se coloca el gel, se llena con solución amortiguadora con sales que puede conducir la corriente. Aunque tal vez no puedas verlo en la imagen superior (gracias a mis fabulosas habilidades artísticas), la solución amortiguadora llena la cámara hasta un nivel en el que apenas cubre el gel.
El extremo del gel que tiene los pozos se coloca hacia el electrodo negativo. El extremo sin pozos (hacia donde migrarán los fragmentos de ADN) se coloca hacia el electrodo positivo.
¿Cómo se mueven los fragmentos de ADN a través del gel?
Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN que queremos analizar (por ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido digerido con enzimas de restricción) se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos. Un pozo se reserva para el marcador de peso molecular, un estándar de referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Los marcadores de ADN comerciales cubren diferentes intervalos de tamaños, por lo que trataremos de usar uno con buena "cobertura" en el intervalo de tamaños en el que esperamos encontrar nuestros fragmentos.
A continuación, se aplica energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir corriente a través del gel. Los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una carga negativa a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de gel hacia el polo positivo. Cuando el sistema está encendido y pasa corriente por el gel, se dice que el gel está corriendo.
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos corriendo por demasiado tiempo (¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!).
Visualización de los fragmentos de ADN
Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel.
Una "línea" de ADN bien definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un gran número de fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma posición. Un fragmento único de ADN (o incluso un pequeño grupo de fragmentos de ADN) no sería visible por sí mismo en un gel.
Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos determinar su tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene un tamaño aproximado de
Comprueba tu comprensión
En el gel anterior se numeran cuatro carriles. (Un carril es un corredor por el cual pasa el ADN al salir de un pozo).
¿Qué carril corresponde a las siguientes descripciones?
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¿Quieres saber más sobre la electroforesis en gel? Mira esta herramienta interactiva desplegable y esta simulación de LabXchange.
LabXchange es una plataforma de educación en ciencias gratuita en línea creada en la Facultad de Artes y Ciencias de Harvard que recibe apoyo de Amgen Foundation.
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En la pregunta "este carril contiene un fragmento de ADN de 1500 pares de bases (pb)", podrían dar una explicación acerca de esto? Mi maestra dice que esa no es la respuesta y pienso que tal vez ella está en lo correcto. La respuesta correcta es 2000?(1 voto)- Hay doso bandas, uno de 1500 y una mas grande de 2000(4 votos)
- El formato es entendible, pero creo que la información es muy general, pero es muy clara.(2 votos)
- Tengo una duda... se supone que esta técnica es utilizada para separar fragmentos de ADN según su longitud. En el caso de que sean genes de nuestro interés, no se supone que todos tienen el mismo tamaño? Entonces cómo hacen algunos para unirse en fragmentos más grandes o más cortos?(2 votos)
- Algunas veces puede deberse a que el ADN se encuentra concatenado y eso puede llevar a que exista pequeñas variaciones en el tamaño de las bandas.(1 voto)
- Hola,que debo hacer para obtener los pesos moleculares de las bandas de ADN mediante una regresión lineal entre el logaritmo del peso mol de las moléculas y la distancia recorrida en el gel(1 voto)
- ¿Que significa que algunas bandas sean más brillantes que otras?(1 voto)
- Es por la cantidad de adn en el pozo, o tambien puede deverse a la pureza de la muestra.(1 voto)
- La electroforesis depende de la longitud de la molécula, pero también afecta el plegamiento de esta?, es decir el superenrollamiento afecta al recorrido?, hay modelos matemáticos para dilucidar este proceso?(1 voto)
- Hola! En realidad no conozco modelos matemáticos pero puedo decirte que el plegamiento afecta si estas hablando de DNA circular, como el de un plasmidio. Existen tres conformaciones posibles, el super-enrollado, circular abierto y lineal. Evidentemente el lineal quedará más abajo en el gel, luego el super-enrollado y finalmente el circular abierto que es el que genera más fricción contra el gel, a pesar de que tienen el mismo número de pares de bases. Por el contrario si el ADN sólo es lineal no hay forma de que el plegamiento afecte. Cuando es circular (plamidial), normalmente se digiere con enzimas de restricción, por lo que se encuentra lineal en el gel (dos o más fragmentos).(1 voto)
- ¿dónde se encontrará el ADN?(1 voto)
- una pregunta, a veces aparece ARN en la parte inferior a qué se debe ?(1 voto)
- ¿Cómo se sintetiza la agarosa?(1 voto)
- En el gel anterior se numeran cuatro carriles. (Un carril es un corredor por el cual pasa el ADN al salir de un pozo).(1 voto)