Cómo ocurre la replicación del ADN: experimento de Meselson-Stahl

Un experimento clave histórico que demostró el mecanismo semiconservativo de la replicación del ADN.

Puntos más importantes:

  • Se consideraron tres modelos de cómo los organismos podrían replicar su ADN: semiconservativo, conservativo y dispersivo.
  • El modelo semiconservativo, en el que cada cadena de ADN sirve como molde para hacer una nueva cadena complementaria, parecía el más probable tomando en cuenta la estructura del ADN.
  • Meselson y Stahl probaron los modelos al marcar el ADN de las bacterias con isótopos de nitrógeno a lo largo de varias gneraciones.
  • A partir de los patrones de ADN marcado que vieron, Meselson y Stahl confirmaron que el ADN se replica de forma semiconservativa.

El modo de replicación del ADN

Imagínate en 1953, justo después de que se descubrió la estructura de doble hélice del ADN1^1. ¿Qué preguntas podrías estar ponderando tú y otros otros científicos?
Una gran pregunta era sobre la replicación del ADN. La estructura de doble hélice del ADN proporcionó una tentadora pista sobre cómo ocurre el copiado1,2^{1,2}. Parecía probable que las dos cadenas complementarias de la hélice se separaran durante la replicación, y cada una sirviera como un molde para la construcción de una nueva cadena complementaria.
¿Pero realmente fue ese el caso? Tal vez te arruinemos el final, pero ¡la respuesta es sí! En este artículo, veremos un famoso experimento, a veces llamado "el experimento más hermoso de la biología", que estableció que el mecanismo básico de replicación del ADN es semiconservativo, es decir, que produce moléculas de ADN que contienen una cadena nueva y una vieja3^3.

Los tres modelos de replicación del ADN

La comunidad científica había propuesto tres modelos básicos sobre la replicación del ADN después del descubrimiento de la estructura del ADN. Estos modelos se ilustran en el siguiente diagrama:
Representación esquemática de los modelos de replicación del ADN
  1. Conservativa. La replicación produce una hélice hecha completamente de ADN viejo y una hélice hecha completamente de ADN nuevo.
  2. Semiconservativa. La replicación produce dos hélices que contienen una cadena de las cadenas originales del ADN y una cadena nueva.
  3. Dispersiva. La replicación produce dos hélices cuyas cadenas individuales son una mezcla del ADN viejo y nuevo.
_Imagen modificada de "Introducción a la replicación del ADN: Figura 1", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0)._
  • Replicación semiconservativa. En este modelo, las dos cadenas de ADN se desenrollan y cada una sirve como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto resulta en dos moléculas de ADN, cada una con una cadena original y una nueva.
  • Replicación conservativa. En este modelo, la replicación del ADN resulta en una molécula compuesta por las dos cadenas de ADN originales (idéntica a la molécula original de ADN) y otra molécula compuesta por dos cadenas nuevas (con exactamente la misma secuencia que la molécula original).
  • Replicación dispersiva. En el modelo dispersivo, la replicación del ADN resulta en dos moléculas de ADN que son mezclas, o "híbridos", del ADN original y las moléculas hijas. En este modelo, cada cadena individual es un mosaico de ADN original y nuevo.
La mayoría de los biólogos en ese tiempo probablemente habrían apostado por el modelo semi-conservativo. Este modelo tenía mucho sentido dada la estructura de doble hélice del ADN, en la que las dos cadenas de ADN son perfecta y predeciblemente complementarias entre sí (donde una tiene una T, la otra tiene una A; cuando una tiene una G, la otra tiene una C; etc.)2,4^{2,4}. Esta relación facilitaba imaginar a cada cadena sirviendo como un molde para la síntesis de una nueva pareja.
Sin embargo, la biología también está llena de ejemplos en los que la solución "obvia" resulta no ser la correcta. (Las proteínas son el material genético... ¿lo recuerdas?). Por lo tanto, era clave determinar experimentalmente cuál modelo realmente utilizaban las células cuando replicaban su ADN.

Meselson y Stahl resolvieron el acertijo

Matt Meselson y Franklin Stahl originalmente se conocieron en el verano de 1954, un año después de que Watson y Crick publicaran su artículo sobre la estructura del ADN. Aunque los dos investigadores tenían intereses diferentes, ambos estaban intrigados por la interrogante sobre la replicación del ADN y decidieron formar equipo y tratar de resolver cuál era el mecanismo de replicación5^5.

El experimento de Meselson-Stahl

Meselson y Stahl realizaron sus famosos experimentos sobre la replicación de ADN utilizando bacterias E. coli como sistema modelo.
Comenzaron cultivando E. coli en medio, o caldo nutritivo, que contenía un isótopo "pesado" de nitrógeno, 15N^{15}\text N. (Un isótopo solo es una versión de un elemento que difiere de otras versiones por el número de neutrones en su núcleo). Cuando se cultivan bacterias en medio que contiene 15N^{15}\text N pesado, estas toman el nitrógeno y lo utilizan para sintetizar nuevas moléculas biológicas, incluyendo ADN.
Después de que muchas generaciones crecieron en medio con 15N^{15}\text N, todas las bases nitrogenadas del ADN de las bacterias quedaron marcadas con 15N^{15}\text N pesado. Luego, a las bacterias las cambiaron al medio con el isótopo “ligero” 14N^{14}\text N y se les permitió crecer durante varias generaciones. El ADN que se produjera después del cambio tendría que estar formado por 14N^{14}\text N, ya que este habría sido el único nitrógeno disponible para la síntesis de ADN.
Meselson y Stahl conocían la frecuencia con la que las células de E. coli se dividían, por lo que pudieron recolectar pequeñas muestras de cada generación para extraer y purificar su ADN. Luego, midieron la densidad del ADN (e, indirectamente, su contenido de 15N^{15}\text N y 14N^{14}\text N) mediante centrifugación en gradiente de densidad.
Este método separa moléculas como el ADN en bandas al hacerlas girar a gran velocidad en presencia de otra molécula, como el cloruro de cesio, que forma un gradiente de densidad de la parte superior a la parte inferior del tubo que gira. La centrifugación en gradiente de densidad permite detectar diferencias muy pequeñas, como las que hay entre el ADN marcado con 15N^{15}\text N y 14N^{14}\text N.
Diagrama de un tubo de ensayo que contiene CsCl, ADN marcado con nitrógeno-14 y nitrógeno-15 después de centrifugación a alta velocidad. La densidad del medio en el tubo de ensayo es mayor en el fondo y menor en la superficie, gracias a la formación del gradiente de CsCl. El ADN marcado con nitrógeno-14 forma una banda relativamente cerca de la superficie del tubo de ensayo, mientras que el ADN marcado con nitrógeno-15 forma una banda más cercana al fondo del tubo. Las posiciones de las bandas reflejan sus densidades relativas.
_Imagen modificada de "Diagrama del experimento de Meselson-Stahl", por Mariana Ruiz Villarreal (dominio público)._

Resultados del experimento

Cuando el ADN de las primeras cuatro generaciones de E. coli se analizó, se obtuvo el patrón de bandas que se muestra en la siguiente figura:
_Imagen modificada de "Introducción a la replicación del ADN: Figura 2", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0). Arte original de "Diagrama del experimento de Meselson-Stahl", por Mariana Ruiz Villarreal (dominio público)._
¿Qué les indicó a Meselson y Stahl este resultado? Vamos a revisar las primeras generaciones, las cuales proporcionan la información clave.

Generación 0

El ADN aislado de células al inicio del experimento ("generación 0" justo antes del cambio al medio con 14N^{14}\text N) produce una única banda después de la centrifugación. Este resultado tenía sentido porque el ADN solo debería contener 15N^{15}\text N pesado en ese momento.

Generación 1

El ADN aislado después de una generación (una ronda de replicación del ADN) también produce una única banda al centrifugarse. Sin embargo, esta banda estaba más alto, tenía una densidad intermedia entre el ADN pesado con 15N^{15}\text N y el ADN ligero con 14N^{14}\text N.
La banda intermedia indicó a Meselson y Stahl que las moléculas de ADN producidas en la primera ronda de replicación eran un híbrido de ADN ligero y pesado. Este resultado encajaba con los modelos dispersivo y semiconservativo, pero no con el modelo conservativo.
El modelo conservativo habría predicho dos bandas diferentes en esta generación (una banda de la molécula pesada original y una banda de la molécula ligera recién hecha).

Generación 2

La información de la segunda generación le permitió a Meselson y Stahl determinar cuál de los modelos restantes (semiconservativo o dispersivo) era realmente el correcto.
Cuando centrifugaron el ADN de la segunda generación, se produjeron dos bandas. Una estaba en la misma posición que la banda intermedia de la primera generación, mientras que la segunda estaba más alto (parecía estar marcada solamente con 14N^{14}\text N).
Este resultado permitió a Meselson y Stahl saber que el ADN se replicaba semiconservativamente. El patrón de dos bandas distintas —una en la posición de una molécula híbrida y una en la posición de una molécula ligera— es justo lo que se esperaría de la replicación semiconservativa (como se ilustra en el siguiente diagrama). En cambio, en la replicación dispersiva, todas las moléculas deberían tener fragmentos del ADN viejo y del nuevo, lo que haría imposible obtener una molécula "puramente ligera".
Diagrama del experimento de Meselson-Stahl. Todo el ADN está marcado inicialmente con nitrógeno-15. Se toma una muestra de ADN antes de añadir las bacterias al medio con nitrógeno-14 y al centrifugarlo en un gradiente de CsCl, el ADN forma una única banda baja en el tubo (que indica que el ADN está marcado con nitrógeno-15). Esto se etiqueta como "generación 0".
Luego, las bacterias se agregan al medio con nitrógeno-14 y crecen durante cuatro generaciones. En cada generación (que tarda unos 20 minutos en crecer), se toma una muestra de ADN y se analiza por centrifugación en un gradiente de CsCl.
  • Generación 0 (ver arriba). 100% del ADN en la banda de nitrógeno-15.
  • Generación 1. 100% del ADN en una banda con posición intermedia entre las bandas de nitrógeno-14 y nitrógeno-15.
  • Generación 2. 50% del ADN en una banda con posición intermedia entre las bandas de nitrógeno-14 y nitrógeno-15. 50% del ADN en la banda de nitrógeno-14.
  • Generación 3. 25% del ADN en una banda con posición intermedia entre las bandas de nitrógeno-14 y nitrógeno-15. 75% del ADN en la banda de nitrógeno-14.
  • Generación 4. 12% del ADN en una banda con posición intermedia entre las bandas de nitrógeno-14 y nitrógeno-15. 88% del ADN en la banda de nitrógeno-14.
El panel de la derecha de la figura es una ilustración que muestra cómo estos resultados pueden explicarse con el modelo semiconservativo. La doble hélice inicial se marca totalmente con nitrógeno-15 (generación 0). La replicación de esta hélice produce dos hélices, cada una de las cuales contiene una cadena con nitrógeno-15 (viejo) y una cadena con nitrógeno-14 (nuevo) (generación 1). La replicación de estas dos hélices produce cuatro hélices, dos que también son híbridas de nitrógeno-15/nitrógeno-14 y dos que están hechas solo de nitrógeno-14 (generación 2). La replicación de las hélices de la generación 2 produce ocho hélices, dos de los cuales son híbridas de nitrógeno-15/nitrógeno-14 y seis que están hechas solo de nitrógeno-14 (generación 3). La replicación de las hélices de la generación 3 produce dieciséis hélices, dos de los cuales son híbridas de nitrógeno-15/nitrógeno-14 y 14 que están hechas solo de nitrógeno-14 (generación 4).
_Imagen modificada de "Introducción a la replicación del ADN: Figura 2", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0). Arte original de "Diagrama del experimento de Meselson-Stahl", por Mariana Ruiz Villarreal (dominio público)._

Generaciones 3 y 4

En el modelo semiconservativo, se esperaría que cada molécula de ADN híbrido en la segunda generación diera lugar a una molécula híbrida y una molécula ligera en la tercera generación, mientras que cada molécula de ADN ligero solo produciría más moléculas ligeras.
Así, en la tercera y cuarta generación, esperaríamos que la banda híbrida fuera progresivamente más débil (porque representaría una fracción más pequeña del ADN total) y que la banda ligera fuera progresivamente más fuerte (porque representaría una fracción más grande).
Como podemos ver en la figura, Meselson y Stahl vieron justo este patrón en sus resultados, lo que confirmó un modelo de replicación semiconservativa.
El modelo dispersivo predice que cada molécula de ADN que se replica debe ser un mosaico de ADN parental (de la generación anterior) y de ADN hijo (recién sintetizada durante la replicación). En términos mecánicos, es como si el ADN viejo y nuevo se cortaran durante la replicación, se intercambiaran uno con el otro, y luego se volvieran a unir las hélices. Así, cada ronda de replicación bajo el modelo de dispersión produciría moléculas mezcladas con secciones pesadas y ligeras. Las moléculas de ADN mezclado contendrían una fracción cada vez mayor de 14N^{14}\text N con cada repetición sucesiva, por lo que la densidad del ADN disminuiría gradualmente con el tiempo y resultaría en una banda (o una banda difusa/un barrido) que se mueve cada vez más alto con cada generación.
Bajo el modelo conservativo, si comenzamos con una sola cadena "pesada" de ADN (15N^{15}\text N), después de una ronda de replicación tendríamos la molécula pasada de ADN original junto con una nueva molécula ligera. Si estas moléculas de ADN experimentaran una segunda ronda de replicación, ¿qué veríamos? Habría una molécula pesada de ADN y tres moléculas ligeras. Y después de una tercera ronda de replicación, tendríamos con una molécula pesada y siete ligeras.
Este patrón muestra que, bajo el modelo conservativo, el ADN pesado nunca desaparece totalmente pero es superado en número rápidamente por las moléculas recién sintetizadas de ADN ligero. También puedes ver que la replicación conservativa nunca produce las moléculas híbridas que se ven en los otros dos modelos. Esta diferencia permitió que Meselson y Stahl eliminaran el modelo conservativo después de una sola generación.

Conclusión

El experimento de Meselson y Stahl demostró que el ADN se replicaba de forma semiconservativa, lo que significa que cada cadena de una molécula de ADN sirve como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria.
Aunque Meselson y Stahl hicieron sus experimentos en la bacteria E. coli, hoy en día sabemos que la replicación semi-conservativa del ADN es un mecanismo universal que comparten todos los organismos del planeta Tierra. ¡Algunas de tus células están replicando su ADN semi-conservativamente justo ahora!

Créditos:

Este artículo es un derivado modificado de "Introducción a la replicación del AdN," por OpenStax College, Biology, CC BY 4.0. Descarga sin costo el artículo original en http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10.53.
El artículo modificado está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias citadas:

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  2. Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). The basic principle: Base pairing to a template strand (El principio básico: Apareamiento de bases con una cadena molde). En Campbell biology (10° ed.). San Francisco, CA: Pearson, 318-319.
  3. American Institute of Biological Sciences. (2003). Biology's most beautiful (Lo más hermoso de la biología). http://www.aibs.org/about-aibs/030712_take_the_bioscience_challenge.html.
  4. Watson, J. D. y Crick, F. H. C. (1953). Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid (Implicaciones genéticas de la estructura del ácido ribonucleico). Nature, 171, 740-741.
  5. Davis, T. H. (2004). Meselson and Stahl: The art of DNA replication (Meselson y Stahl: el arte de la replicación del ADN). PNAS, 101(52), 17895-17896. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0407540101.

Referencias:

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