Fundamentos de las gráficas de cinética enzimática

Cómo leer gráficas de cinética enzimática (y cómo se hacen). Km y Vmáx. Inhibidores competitivos y no competitivos.

Introducción

Imaginemos que quieres comprar un automóvil deportivo. ¿Qué te gustaría saber sobre las diferentes opciones (Ferrari, Porsche, Jaguar, etc.) para decidir cuál es el mejor? Uno de los factores obvios sería qué tan rápido puede correr cuando pisas el acelerador a fondo. Pero tal vez también quieras saber información más detallada sobre su rendimiento, como qué tan rápido puede acelerar de 0 a 100 km/hr. En otras palabras, en lugar de saber únicamente su velocidad máxima, también querrías saber la cinética de cómo el automóvil alcanza esa velocidad.
Los bioquímicos tienden a sentirse de manera semejante con respecto a las enzimas que estudian. Quieren saber todo lo que puedan sobre los efectos de una enzima en la velocidad de reacción, no solo qué tan rápida puede ser cuando trabaja a todo lo que da.
De hecho, puedes obtener una gran cantidad de información sobre el funcionamiento de una enzima y su interacción con otras moléculas, como los inhibidores, tan solo con medir qué tan rápido cataliza una reacción bajo una serie de condiciones diferentes. La información obtenida en estos experimentos generalmente se representa en forma de gráficas, por lo que dedicaremos un poco de tiempo a discutir cómo se elaboran dichas gráficas (y cómo se leen para obtener el máximo provecho de ellas).

Fundamentos de las gráficas de cinética enzimática

Las gráficas como la que se ve a continuación (que muestra la velocidad de reacción como una función de la concentración de sustrato) se usan a menudo para mostrar información sobre cinética enzimática. Proporcionan una gran cantidad de información útil, pero también pueden resultar muy confusas la primera vez que las ves. Aquí, iremos paso a paso por el proceso de elaboración e interpretación de una de estas gráficas.
Gráfica de cinética enzimática que muestra la velocidad de reacción como una función de la concentración del sustrato.
Imagen modificada de "Enzimas: Figura 3", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0).
Imagina que tienes tu enzima favorita en un tubo de ensayo y quieres saber más acerca de cómo se comporta bajo distintas condiciones. Así que realizas una serie de pruebas en las que tomas diferentes concentraciones de sustrato -digamos, 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M y 1.0 M- y encuentras la velocidad de reacción (qué tan rápido tu sustrato se convierte en producto) cuando añades enzima en cada caso. Por supuesto, tienes que ser cuidadoso para añadir la misma concentración de enzima en cada reacción, de forma que puedas comparar manzanas con manzanas.
¿Cómo determinas la velocidad de reacción? Bueno, lo que en realidad quieres es la velocidad de reacción inicial, justo en el momento en que combinas el sustrato y la enzima, y esta cataliza la reacción tan rápido como puede a esa concentración particular de sustrato (porque la velocidad de reacción disminuirá a cero conforme se usa el sustrato). De este modo, medirías la cantidad de producto sintetizado por unidad de tiempo al inicio de la reacción, cuando la concentración de producto aumenta en forma lineal. Este valor, la cantidad de producto sintetizado por unidad de tiempo al inicio de la reacción, se llama velocidad inicial o V0V_0 para esa concentración.
Digamos que ya encontraste los valores V0V_0 para todas las concentraciones que te interesan. Ahora puedes trazar cada concentración de sustrato con su V0V_0 como un par (X, Y). Una vez que hayas trazado todos los pares (X, Y) para las diferentes concentraciones, podrás conectar los puntos por medio de una curva que mejor se ajuste a ellos para obtener una gráfica. Para muchos tipos de enzimas la gráfica que se obtiene se parece mucho a la línea morada que se muestra más arriba: los valores de V0V_0 se incrementan rápidamente en concentraciones bajas de sustrato, luego se estabilizan a una meseta plana en altas concentraciones de sustrato.
Gráfica de cinética enzimática que muestra la velocidad de reacción como una función de la concentración del sustrato, se señala la Vmáx (velocidad máxima) y la Km (concentración de sustrato cuando la velocidad de reacción es 1/2 Vmáx).
Imagen modificada de "Enzimas: Figura 3", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0).
Esta meseta se genera porque la enzima está saturada, es decir, todas la moléculas de enzima disponibles ya están ocupadas procesando sustratos. Cualquier molécuala adicional de sustrato tendrá que esperar hasta que una enzima se desocupe, por lo que la velocidad de reacción (la cantidad de producto generado por unidad de tiempo) está limitada por la concentración de enzima. Esta velocidad máxima de reacción es característica de una enzima en particular a una concentración dada y se conoce como velocidad máxima o VmaxV_{max}. La VmaxV_{max} es el valor de Y (valor inicial de velocidad de reacción) en el cual se estabiliza la gráfica anterior.
La concentración de sustrato que da una velocidad que está a la mitad de la VmaxV_{max} se llama KmK_m y es una medida útil sobre la rapidez con que aumenta la velocidad de reacción respecto a la concentración del sustrato. La KmK_m también es una medida de la afinidad de una enzima por su substrato (la tendencia a unirse a él). Una KmK_m más baja corresponde a una mayor afinidad por el sustrato, mientras que una KmK_m más alta corresponde a una menor afinidad por el sustrato. A diferencia de la VmaxV_ {max}, que depende de la concentración de enzima, KmK_m siempre es la misma para una enzima particular en una reacción determinada (aunque la KmK_m "aparente", medida experimentalmente, puede modificarse por inhibidores, como se explica a continuación).

Gráficas de cinética enzimática e inhibidores

Bueno, ¿pero qué son los inhibidores? Ya hemos hablado de dos tipos de inhibidores, competitivos y no competitivos, en el artículo sobre regulación enzimática.
  • Los inhibidores competitivos afectan el progreso de la reacción al unirse a una enzima, por lo general en el sitio activo, y evitan que el sustrato real se una. En un momento dado, solo el inhibidor competitivo o el sustrato pueden unirse a la enzima (no ambos). Es decir, el inhibidor y el sustrato compiten por la enzima. La inhibición competitiva actúa disminuyendo el número de moléculas de enzima disponibles para unirse el substrato.
  • Los inhibidores no competitivos no impiden que el sustrato se una a la enzima. De hecho, el inhibidor y el substrato no afectan la unión del otro con la enzima en lo absoluto. Sin embargo, cuando el inhibidor se une, la enzima no puede catalizar su reacción para producir un producto. De esta forma, la inhibición no competitiva actúa reduciendo el número de moléculas funcionales de enzima que pueden realizar la reacción.
Si quisiéramos mostrar los efectos de estos inhibidores en una gráfica como la de arriba, podríamos repetir el experimento completo dos veces más: añadiendo cierta cantidad de inhibidor competitivo a cada reacción de prueba en una y con cierta cantidad de inhibidor no competitivo en otra. Obtendríamos los siguientes resultados:
Gráfica de cinética enzimática que muestra la velocidad de reacción como una función de la concentración del sustrato para una enzima normal, una enzima con un inhibidor competitivo y un inhibidor no competitivo. Para el inhibidor competitivo, la Vmax es la misma que para la enzima normal, pero la Km es mayor. Para el inhibidor no competitivo, la Vmax es menor que para la enzima normal, pero la Km es la misma.
Imagen modificada de "Enzimas: Figura 3", de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0).
  • Con un inhibidor competitivo, la reacción puede alcanzar en algún momento su VmaˊxV_{máx} normal, pero se necesita de una mayor concentración de sustrato para alcanzarla. En otras palabras, VmaˊxV_{máx} no cambia, pero la KmK_m aparente es mayor. ¿Por qué se debe agregar más sustrato para alcanzar VmaˊxV_{máx}? El sustrato extra hace que las moléculas de sustrato tengan la abundancia suficiente para “ganarle” consistentemente a las moléculas de inhibidor su lugar en la enzima.
  • Con un inhibidor no competitivo, la reacción nunca puede alcanzar su VmaˊxV_{máx}, sin importar cuánto sustrato añadamos. Un subconjunto de las moléculas de enzima siempre estará "envenenado" por el inhibidor, por lo que se reduce la concentración efectiva de la enzima (que determina la VmaxV_{max}). Sin embargo, la reacción alcanza la mitad de su nueva VmaˊxV_{máx} en la misma concentración de sustrato, por lo que KmK_m no cambia. El hecho de que KmK_m no cambie refleja que el inhibidor no afecta la unión de la enzima con el sustrato, solo disminuye la concentración de enzima utilizable.
Los inhibidores competitivos y no competitivos son dos claras categorías de inhibidores que tienen un comportamiento cinético bien definido, razón por la cual se suelen presentar en cursos introductorios de biología. Sin embargo, hay otros tipos de inhibidores que tienen diferentes efectos en VmaˊxV_{máx} y KmK_m.
Los diferentes tipos de inhibidores se distinguen por la molécula o complejo al que se unen: la enzima libre, el complejo enzima-sustrato o a ambos (así como por sus afinidades relativas hacia estas dos formas). Para conocer más acerca de los inhibidores y la teoría detrás de su comportamiento, te recomendamos la sección de cinética enzimática de Michaelis-Menten.
Para resumir brevemente algunas de las principales categorías de inhibidores:
  • Un inhibidor competitivo, como se mencionó anteriormente, se une solo a la enzima libre (y no se puede unir al complejo enzima-sustrato). La inhibición competitiva no afecta VmaˊxV_{máx}, pero aumenta la KmK_m aparente.
  • Un inhibidor acompetitivo (¡que no es lo mismo que un inhibidor no competitivo!) solo se une al complejo enzima-sustrato, pero no a la enzima libre. Un inhibidor acompetitivo reduce VmaˊxV_{máx}, pero aumenta la KmK_m aparente.
  • Un inhibidor mixto muestra un comportamiento intermedio al de los inhibidores competitivos y acompetitivos. Este se une a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato, pero tiene una afinidad (tendencia a unirse) más alta hacia una forma que la otra. Los inhibidores mixtos reducen consistentemente VmaˊxV_{máx}, pero pueden aumentar o disminuir la KmK_m aparente, dependiendo de a qué forma de la enzima (libre o unida a sustrato) se unan con más fuerza1^1.
  • Un inhibidor no competitivo, como se mencionó anteriormente, se une a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato, y no altera el equilibrio entre ellos. (En otras palabras, tiene igual afinidad por la enzima y por el complejo enzima-sustrato.) La inhibición no competitiva en realidad solo es un caso especial de inhibición mixta, en la que el inhibidor resulta tener la misma afinidad por la enzima y por el complejo enzima-sustrato. La inhibición no competitiva pura disminuye VmaˊxV_{máx}, pero no altera la KmK_m1^1.

Modelo de Michaelis-Menten y enzimas alostéricas

Muchas enzimas actúan de manera similar a la enzima hipotética del ejemplo anterior, generan curvas parabólicas cuando se grafica la velocidad de reacción como función de la concentración de sustrato. Las enzimas que muestran este comportamiento pueden describirse la mayoria de las veces con una ecuación que relaciona la concentración del sustrato, la velocidad inicial, la KmK_m, y la VmaxV_{max}, conocida como ecuación de Michaelis-Menten. Las enzimas cuya cinética obedece dicha ecuación se denominan enzimas michaelianas. Si quieres revisar con más detalle la ecuación de Michaelis-Menten y el modelo en el que se basa, puedes ver los videos sobre Michaelis-Menten en la sección del MCAT.
Las enzimas Michaelis-Menten son diferentes a las enzimas alostéricas (vistas en el artículo principal sobre regulación enzimática). Las enzimas alostéricas normalmente tienen múltiples sitios activos y a menudo muestran cooperatividad, esto es, que la unión de un sustrato a un sitio activo aumenta la capacidad de otros sitios activos para unir y procesar sustratos.
Gráfica de la velocidad de reacción como una función de la concentración de sustrato para una enzima cooperativa. La curva tiene forma de S (sigmoide), con una marcada transición de velocidad de reacción baja a velocidad alta en un rango estrecho de concentraciones de sustrato.
Las enzimas cooperativas son más sensibles en su respuesta a los cambios en las concentraciones de sustrato que otras enzimas y exhiben una transición "tipo interruptor" de una velocidad de reacción baja a una alta conforme aumenta la concentración de sustrato. Esto corresponde a una curva de velocidad contra sustrato con forma de S, como se muestra arriba.

Créditos:

Este artículo es un derivado modificado de "Enzimas" de OpenStax College, Biología (CC BY 3,0). Descarga sin costo el artículo original en http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@9,85.
El artículo modificado está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias citadas:

  1. Brandt, M. (2010). Inhibition kinetics (Cinética inhibitoria). En CHEM 330 biochemistry website, 8. Consultado en https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.

Referencias:

Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2002). The Michaelis-Menten model accounts for the kinetic properties of many enzymes (El modelo Michaelis-Menten explica las propiedades cinéticas de muchas enzimas). En Biochemistry (Bioquímica) (5th ed., section 8,4). Nueva York, NY: W. H. Freeman. Tomado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22430/.
Berg, J. M., Tymoczko, J. L. y Stryer, L. (2007). Enzymes can be inhibited by specific molecules (Las enzimas pueden inhibirse con moléculas específicas). En Biochemistry (6° ed., sección 225-234). Nueva York, NY: W. H. Freeman.
Brandt, M. (2010). Inhibition kinetics (Cinética inhibitoria). En CHEM 330 biochemistry website, 80-83. Consultado en https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.
Gutierrez, R. (2011). Bio41 Week 5 — Biochemistry Lectures 4-6 (Bio41 semana 5 — Conferencias de bioquímica 4-6). Biosci 41, Stanford.
Mixed inhibition. (Inhibición mixta; 2 de diciembre de 2015). Consultado el 15 de febrero de 2016 en Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Mixed_inhibition.
Non-competitive inhibition. (Inhibición no competitiva; 2 de diciembre de 2015). Consultado el 15 de febrero de 2016 en Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-competitive_inhibition.
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