Introducción a los microscopios y su funcionamiento. Abarca la microscopía de campo claro, microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica.

Introducción

Si conocieras algunos biólogos celulares y les preguntaras acerca de lo que más disfrutan de su trabajo, encontrarías que se reduce a una sola cosa: en secreto, todos son adictos a los microscopios. Al final del día, lo que realmente aman es poder sentarse en un pequeño cuarto oscuro durante horas y observar su tipo de célula favorito por medio de las lentes de un microscopio. Esto puede parecer extraño, pero la verdad es que las células pueden ser muy bellas, como vitrales vivientes. Uno de mis ejemplos favoritos es la fotografía siguiente que muestra las células en una hoja joven de Arabidopsis thaliana, una pequeña planta con flores pariente de la mostaza.
Imagen de microscopía confocal de una hoja joven de arabidopsis, con un marcador delineando las células y otros marcadores indicando las células jóvenes del linaje estomático (células que en última instancia darán lugar a estomas, válvulas celulares utilizadas para intercambio gaseoso).
Crédito de la imagen: Carrie Metzinger Northover, Bergmann Lab, Stanford University
Esta imagen no es una simple micrografía; es una imagen fluorescente de una planta preparada de manera especial, en la que las diferentes partes de la célula fueron marcadas con tinciones que las hacen brillar. Aun así, este tipo de belleza y complejidad está a nuestro alrededor, seamos capaces o no de verlo.
Puedes encontrar células con patrones así de intrincados y bellos en cualquier planta que mires, desde las rosas de tu jardín, al pasto que crece en las grietas de la acera, hasta las zanahorias que te comiste de botana. Lo anterior no se limita a las plantas: podemos encontrar exquisitas capas de células en tu piel, en el ala de un insecto y en cualquier otro tejido vivo que quieras ver. Nosotros, y el mundo que nos rodea, somos catedrales hechas de células. Solo necesitamos un microscopio para poder apreciarlo.

Microscopios y lentes

Aunque las células varían de tamaño, generalmente son bastante pequeñas. Por ejemplo, el diámetro de un glóbulo rojo humano típico es de alrededor de ocho micrometros (0.008 milímetros). Poniéndolo en contexto, la cabeza de un alfiler es de alrededor de un milímetro de diámetro, así que pueden alinearse unos 125 glóbulos rojos a lo ancho de la cabeza del alfiler. Con algunas excepciones, las células individuales no pueden verse a simple vista, así que los científicos deben utilizar microscopios (micro-= "pequeño"; -scopio= "ver") para estudiarlas. Un microscopio es un instrumento que aumenta los objetos que son demasiado pequeños para poder verlos, produciendo una imagen en la que el objeto parece más grande. La mayoría de las fotografías de células se toman utilizando un microscopio y dichas imágenes se conocen también como micrografías.
A partir de la definición anterior, podríamos pensar que el microscopio es solo un tipo de lupa. De hecho, las lupas califican como microscopios y, dado que tienen un solo lente, se les llama microscopios simples. Los instrumentos más sofisticados que visualizamos como microscopios son los microscopios compuestos, lo que significa que tienen lentes múltiples. Debido a la manera en la que están colocados sus lentes, pueden refractar la luz para producir una imagen mucho más grande que la de una lupa.
En un microscopio compuesto con dos lentes, el arreglo de estos tiene una consecuencia interesante: la orientación de la imagen que ves está al revés del objeto real que estás examinando1^{1}<. Por ejemplo, si estuvieras viendo un pedazo de periódico con la letra “e” impresa en él, la imagen que verías a través del microscopio sería “ə”. Los microscopios compuestos más complejos no producen una imagen invertida porque incluyen un lente adicional que vuelve a invertir la imagen a su estado normal.
¿Cuál es la diferencia entre un microscopio básico y la potente máquina utilizada en un laboratorio de investigación? Hay dos parámetros que son especialmente importantes en microscopía: el aumento y la resolución.
  • El aumento es una medida de qué tan grande puede un microscopio (o el conjunto de lentes en un microscopio) hacer que parezca un objeto. Por ejemplo, los microscopios ópticos utilizados normalmente en bachilleratos y universidades aumentan hasta 400 veces el tamaño real de un objeto. De este modo, si algo mide 1 mm de ancho en la vida real, en la imagen microscópica sería de 400 mm de ancho.
  • La resolución de un microscopio o lente es la distancia más corta a la que dos puntos pueden estar separados y distinguirse como objetos separados. Mientras menor sea este valor, mayor será el poder de resolución del microscopio y mejor la nitidez y el detalle de la imagen. Si dos células bacterianas estuvieran muy juntas una de otra en una lámina, podrían verse como un solo punto borroso en un microscopio de poca resolución, pero se verían como entidades separadas en uno de alta resolución.
    Los microscopios de alta calidad tienden a tener un mayor poder de resolución que los baratos simplemente porque son fabricados con más cuidado y funcionan mejor.
    Sin embargo, el poder de resolución está limitado en última instancia por las propiedades físicas de la luz y no por la calidad mecánica del microscopio. Si dos estructuras están separadas por una distancia menor a la mitad de la longitud de onda de la luz usada para la proyección de la imagen, no podrán distinguirse una de otra por microscopía óptica convencional2^2. Este fenómeno se conoce como barrera de difracción.
    La microscopía electrónica (se menciona más adelante) resuelve este problema usando haces de electrones, que tienen longitudes de onda mucho más cortas que la luz. Asimismo, algunas técnicas de microscopía de súper resolución desarrolladas recientemente han permitido la captura (o mejor dicho, la reconstrucción) de imágenes de microscopía cuya resolución está más allá de la barrera de difracción2,3^{2,3}.
Tanto el aumento como la resolución son importantes si quieres obtener una imagen nítida de algo muy pequeño. Por ejemplo, si un microscopio tiene mucho aumento pero baja resolución, todo lo que obtendrás será una versión más grande de una imagen borrosa. Los diferentes tipos de microscopios difieren en su aumento y resolución.

Microscopio óptico

La mayoría de los microscopios para estudiantes se clasifica como microscopios ópticos. En un microscopio óptico, la luz visible pasa a través del espécimen (la muestra biológica que estás mirando) y se curva por medio del sistema de lentes, permitiendo al usuario ver una imagen ampliada. Una de las ventajas de la microscopía óptica es que a menudo se puede realizar en células vivas, por lo que es posible observar a las células llevando a cabo sus comportamientos normales (por ejemplo, migrar o dividirse) bajo el microscopio.
Un microscopio óptico, del tipo encontrado comúnmente en los laboratorios de biología de bachillerato y universidad.
Crédito de imagen: OpenStax Biología. Modificación de obra de "GcG"/Wikimedia Commons
Los microscopios de laboratorio para estudiantes suelen ser de campo claro, lo que significa que la luz visible pasa a través de la muestra y forma una imagen directa, sin modificaciones. Algunas formas un poco más sofisticadas de microscopía óptica usan trucos ópticos para mejorar el contraste, lo que hace que los detalles de las células y tejidos sean más fáciles de ver.
Otro tipo de microscopía óptica es la microscopía de fluorescencia, que se usa para obtener imágenes de muestras que fluorescen (absorben luz de una longitud de onda y emiten otra). La luz de una longitud de onda se usa para excitar las moléculas fluorescentes y la luz de otra longitud de onda que estas emiten se colecta y utiliza para formar una imagen. En la mayoría de los casos, la parte de la célula o tejido que queremos ver no es fluorescente de manera natural, por lo que debe ser marcada con una tinción fluorescente antes de ponerla al microscopio.
La fotografía de la hoja al inicio de este artículo fue tomada usando una técnica especializada de microscopía fluorescente llamada microscopía confocal. Un microscopio confocal usa un láser para excitar una delgada capa de la muestra y colecta solo la luz emitida por la capa objetivo, lo que produce una imagen nítida y sin la interferencia de las moléculas fluorescentes en las capas aledañas4^{4}.

Microscopio electrónico

Algunos tipos de microscopía óptica de vanguardia (más allá de las técnicas que acabamos de mencionar) pueden producir imágenes de alta resolución. Sin embargo, si quieres ver algo extremadamente pequeño a una resolución muy alta, quizás prefieras utilizar una técnica diferente y de eficacia comprobada: la microscopía electrónica.
Los microscopios electrónicos son diferentes de los ópticos porque usan un haz de electrones en lugar de uno de luz para generar la imagen de un espécimen. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que la luz visible y esto hace que los microscopios electrónicos puedan obtener imágenes de mayor resolución que los microscopios ópticos estándar. Los microscopios electrónicos pueden utilizarse para examinar células, pero también para ver las estructuras subcelulares y los compartimientos que hay dentro de ellas.
Sin embargo, tienen una limitación: las muestras a examinar bajo un microscopio electrónico deben estar al vacío (y generalmente requieren una preparación mediante un largo proceso de fijación), lo que significa que no es posible observar células vivas.
Imágenes de bacterias Salmonella tomadas mediante microscopía óptica y microscopía electrónica. Puede verse mucho más detalle en la micrografía electrónica.
Crédito de la Imagen: OpenStax Biología. A: modificación de obra de CDC/Armed Forces Institute of Pathology (CDC/Instituto de patología de las fuerzas armadas), Charles N. Farmer, Rocky Mountain Laboratories. B: modificación de obra de NIAID, NIH; datos de escala de Matt Russell
En la imagen anterior, puedes comparar cómo se ven las bacterias Salmonella en una micrografía óptica (izquierda), con una imagen tomada con un microscopio electrónico (derecha). Las bacterias aparecen como pequeños puntos de color morado en la imagen del microscopio óptico, mientras que en la micrografía electrónica, puedes ver claramente su forma y la textura de su superficie, así como detalles de las células humanas a las que tratan de invadir.
Imagen de un microscopio electrónico. Es muy grande, aproximadamente del tamaño de una estufa industrial.
Crédito de imagen: OpenStax Biología. Modificación de obra de Evan Bench
Hay dos tipos principales de microscopía electrónica. En la microscopía electrónica de barrido (MEB), un haz de electrones se mueve hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la superficie de una célula o tejido, creando una detallada imagen tridimensional de la superficie. Este tipo de microscopía es la que se utilizó para tomar la imagen de la bacteria Salmonella que se muestra arriba, a la derecha.
En cambio, en la microscopía electrónica de transmisión (MET), la muestra se corta en rebanadas extremadamente delgadas (utilizando un cortador con filo de diamante) antes de ponerla al microscopio, y el haz de electrones pasa a través de la muestra en lugar de barrer su superficie5^5. La MET se usa con frecuencia para obtener imágenes detalladas de las estructuras internas de las células.
Los microscopios electrónicos, como el que aquí se muestra, son significativamente más grandes y caros que los microscopios ópticos estándar, ¡lo cual no es de extrañar si se toma en cuenta las partículas subatómicas que manejan!

Créditos:

Este artículo es un derivado modificado de “Studying cells (Estudiando las células),” escrito de OpenStax College, Biología (CC BY 3.0). Descarga gratis el artículo original en http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@9.85:16/Biology.
El artículo modificado está autorizado bajo una licencia CC BY-NC-SA 4.0.

Referencias citadas:

  1. Lathrop, K. (s.f.). Light microscopes (Microscopios ópticos). En Ms. Lathrop’s science classes. http://infohost.nmt.edu/~klathrop/Microscopes.htm.
  2. Silfies, J. S., Schwartz, S. A. y Davidson, M. W. (2013). The diffraction barrier in optical microscopy (La barrera de difracción en la microscopía óptica). En MicroscopyU. Tomado de https://www.microscopyu.com/articles/superresolution/diffractionbarrier.html.
  3. Super-resolution microscopy (Microscopía de superresolución). (8 de agosto, 2015). Tomado de Wikipedia el 9 de agosto, 2015: https://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy.
  4. Paddock, S. W., Fellers, T. J., y Davidson, M. W. (2015). Confocal microscopy: Basic concepts (Microscopía confocal: conceptos básicos). En MicroscopyU. Tomado de http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html.
  5. Transmission electron microscopy (Microscopía electrónica de transmisión). (7 de mayo, 2016). Tomado de Wikipedia el 29 de mayo, 2016: https://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy.

Referencias complementarias:

Berestecky, John. (16 de enero, 2008). Microscopy (Microscopía). En Microbiology 140. Tomado de http://www2.hawaii.edu/~johnb/micro/m140/syllabus/week/handouts/m140,2.4.html.
Blueford, J.R. (s.f.). Classification of microscopes (Clasificación de los microscopios). En Microscopes. Tomado de http://www.msnucleus.org/membership/html/jh/biological/microscopes/lesson2/microscopes2c.html.
Confocal microscopy (Microscopía confocal). (16 de julio, 2015). Tomado de Wikipedia el 9 de agosto, 2015: https://en.wikipedia.org/wiki/Confocal_microscopy.
Davidson, M. W. (2015). Resolution (Resolución). En MicroscopyU. Tomado de http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasresolution.html.
DeBroglie wavelength (Longitud de onda de DeBroglie). (s.f.). En HyperPhysics. Tomado de http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/quantum/debrog2.html.
Fluorescence microscopy (Microscopía de fluorescencia). (27 de julio, 2015). Tomado de Wikipedia el 9 de agosto, 2015: https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope.
Lathrop, K. (s.f.). Light microscopes (Microscopios ópticos). En Ms. Lathrop’s science classes. http://infohost.nmt.edu/~klathrop/Microscopes.htm.
Optical microscope (Microscopio óptico). (3 de agosto, 2015). Tomado de Wikipedia el 9 de agosto, 2015: https://en.wikipedia.org/wiki/Optical_microscope.
Purves, W. K., Sadava, D., Orians, G. H., y Heller, H. C. (2003). Microscopes are needed to visualize cells (Se necesitan microscopios para visualizar células). En Life: The science of biology (7th ed., pp. 63-64). Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc.
Raven, P. H., Johnson, G. B., Mason, K. A., Losos, J. B. y Singer, S. R. (2014). Cell structure (La estructura celular). En Biology (Biología) (10° ed., AP ed., págs. 59-87). Nueva York, NY: McGraw-Hill.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). A tour of the cell (Una visita guiada por la célula). En Campbell Biology (10° ed., págs. 92-123). San Francisco, CA: Pearson.
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Super-resolution microscopy (Microscopía de superresolución). (8 de agosto, 2015). Tomado de Wikipedia el 9 de agosto, 2015: https://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy.
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